Протокол использования SpermVD

Процедура витрификации сперматозоидов:

1. Соберите отдельные сперматозоиды в одну или несколько микрокапель среды для промывки спермы в покрытой легким парафиновым маслом чашке Петри.
2. С помощью стерильных щипцов извлеките SpermVD из пакета и поместите на стерильную поверхность чашки Петри или крышки чашки Петри. Покрывать маслом НЕ НУЖНО.
3. В этой же чашке приготовьте раствор для криоконсервации спермы, смешав среду для промывки спермы и среду для замораживания спермы согласно протоколу производителя среды для замораживания.

ВНИМАНИЕ! Среда для промывки сперматозоидов испаряется интенсивнее, чем раствор для замораживания. Чтобы избежать изменения концентрации криопротекторов, обязательно готовьте новую каплю раствора для криоконсервации спермы для каждого нового SpermVD.

4. Поместите три капли раствора для криоконсервации объемом0,8-1 мкл в центр обозначенных областей на SpermVD (Рис. 1).Совет: Старайтесь не делать слишком плоских капель, так как подвижные сперматозоиды рассредоточатся по их большим краям.
5. Сразу же после подготовки аккуратно перенесите SpermVDв культуральную чашку со сперматозоидами (Рис. 2)
6. С помощью микроманипулятора, оснащенного пипеткой для ИКСИ, при 20-кратном увеличении перенесите отдельные сперматозоиды из капель раствора для криоконсервациив SpermVD (Рис. 3). На одном изделии рекомендуется замораживать не более 15-20 клеток, для того чтобы количество замороженных сперматозоидов соответствовало среднему числу полученных за один цикл ооцитов. Совет: Для лучшего контроля прогрессивно-подвижных сперматозоидов допустимо переносить их сначала в каплюPVP, а затем на SpermVD. Помните, что после размораживания сперматозоиды могут потерять подвижность.

ВНИМАНИЕ! SpermVD со сперматозоидами должен быть заморожен не более чем через 8-10 минут с того момента, когда на него поместили первый сперматозоид.

7. Зафиксируйте на держателе для хранения криопробирку объемом 1,8 мл или 3,6 мл и подпишите ее. Осторожно извлеките SpermVD из культуральной чашки и поместите его в эту криопробирку (Рис. 4). Не стоит избавляться от излишков масла на SpermVD, так как слой масла обеспечит дополнительную защиту капель с биоматериалом. Совет: Не затягивайте плотно крышку криопробирки. Это предотвращает создание избыточного давления в пробирке и способствует ее заполнению жидким азотом, который в свою очередь защищает от размораживания, если вдруг криопробирка оказалась вне жидкого азота.
8. Осторожно поместите держатель для хранения в резервуар с жидким азотом. Также допустимо помещать держатель с криопробиркой в ванночку, наполненную жидким азотом и, убедившись, что достаточное количество азота наполнило криопробирку и покрыло SpermVD, перенести держатель для хранения в резервуар с жидким азотом (Рис. 5).

ВНИМАНИЕ! Это самый деликатный этап! Будьте предельно аккуратны при переносе SpermVD в криопробирку, а затем на держатель для хранения или при погружении держателя в резервуар с азотом. Еще недостаточно замороженные капли могут растечься, сместиться или смешаться при резком движении.

Процедура размораживания:

1. Извлеките криопробирку со SpermVD из жидкого азота, осторожно открутите крышку и подождите, пока жидкий азот внутри пробирки испарится. Разместите криопробирку горизонтально при комнатной температуре или на нагревательную поверхность, или в ванночку с водой 37 °С. Дождитесь, пока масло, покрывающее капли, полностью растает.
2. Достаньте SpermVD из криопробирки и поместите в покрытую маслом чашку Петри с одной (и более)каплей среды для промывки спермы дополнительно к стандартным микрокаплям для ИКСИ.
3. При 20-кратном увеличении найдите сперматозоиды и определите их местоположение внутри капель, затем перенесите их со SpermVD в каплю среды для промывки спермы (Рис. 6).

ВНИМАНИЕ! Начинать переносить сперматозоиды со SpermVDв капли со средой для промывки спермы необходимо сразу после того, как SpermVD поместили в масло чашки Петри.

4. После использования утилизируйте SpermVD и чашку Петри в соответствии с требованиями местного законодательства.

рис. 1

рис. 2

рис. 3

рис. 4

рис. 5

рис. 6

ВНИМАНИЕ! Все процедуры, за исключением микроманипуляций и работы с азотом, должны проводиться в стерильных условиях в ламинарном боксе.

6. С помощью микроманипулятора, оснащенного пипеткой для ИКСИ, при 20-кратном увеличении перенесите отдельные сперматозоиды из капель раствора для криоконсервациив SpermVD (Рис. 3). На одном изделии рекомендуется замораживать не более 15-20 клеток, для того чтобы количество замороженных сперматозоидов соответствовало среднему числу полученных за один цикл ооцитов. Совет: Для лучшего контроля прогрессивно-подвижных сперматозоидов допустимо переносить их сначала в каплюPVP, а затем на SpermVD. Помните, что после размораживания сперматозоиды могут потерять подвижность.

7. Зафиксируйте на держателе для хранения криопробирку объемом 1,8 мл или 3,6 мл и подпишите ее. Осторожно извлеките SpermVD из культуральной чашки и поместите его в эту криопробирку (Рис. 4). Не стоит избавляться от излишков масла на SpermVD, так как слой масла обеспечит дополнительную защиту капель с биоматериалом. Совет: Не затягивайте плотно крышку криопробирки. Это предотвращает создание избыточного давления в пробирке и способствует ее заполнению жидким азотом, который в свою очередь защищает от размораживания, если вдруг криопробирка оказалась вне жидкого азота.

8. Осторожно поместите держатель для хранения в резервуар с жидким азотом. Также допустимо помещать держатель с криопробиркой в ванночку, наполненную жидким азотом и, убедившись, что достаточное количество азота наполнило криопробирку и покрыло SpermVD, перенести держатель для хранения в резервуар с жидким азотом (Рис. 5).

ВНИМАНИЕ! Это самый деликатный этап! Будьте предельно аккуратны при переносе SpermVD в криопробирку, а затем на держатель для хранения или при погружении держателя в резервуар с азотом. Еще недостаточно замороженные капли могут растечься, сместиться или смешаться при резком движении.